Zanussi ZT 162 R-2 Manuel d'utilisateur

Charakterisierung und Isolierungvon Allergenen der Tomate(Lycopersicon lycopersicum (L.) Karst. ex Farw.)DissertationZum Erlangen des Doktorgradesdes

1 Einleitung-3-elektrophoretischer Verfahren werden im Rahmen dieser Arbeit ausgewählteTomatenallergene im mikropräparativen Maßstab isoliert und ansc

7 Anhang-93-7.5 EAST-InhibitionDie EAST-Inhibition erfolgt nach einer von MÖLLER et al. [1997] modifizierten Methode nach VIETHS et al.[1993b] unter

7 Anhang-94-Þ jeweils 200 µL Färbelösung in die Vertiefungen pipettierenÞ für die Bestimmung des Blindwertes 2 x jeweils 200 µL Färbelösung in zwei

7 Anhang-95-Bis-Tris gepufferte NuPAGETMverwendete LösungenElektrodenpufferNuPAGETMMES-SDS Running Buffer:97.6 g60.6 g10 g3.0 gMES (2-(N-Morpholino)et

7 Anhang-96-Þ Gel direkt färben (Silber- bzw. CBB-Färbung) oder zum Semidry-Blot einsetzenZusammensetzung der Molekulargewichtsmarker Tab. 7-4:

7 Anhang-97-verwendete GeleNuPAGETM IEF Gel: pI:Gel-Maße:Gel-Typ:3-7 & 3-108 cm x 8 cm x 1 mm10 well & 12 wellDurchführungÞ Lyophilisierte Pr

7 Anhang-98-7.8 2D-ElektrophoreseDie 2D-Elektrophorese wird modifiziert nach GÖRG et al. [1988] unter Verwendung von IEF bzw. SDSFertiggele und -lösu

7 Anhang-99-7.9 Semidry-Blot7.9.1 Semidry-Blot auf NC-MembranenDer Semidry-Blot auf NC-Membranen erfolgt modifiziert nach KHYSE-ANDERSEN [1984].verw

7 Anhang-100-7.9.2 Semidry-Blot auf PVDF-MembranenDie Durchführung erfolgt analog nach WARD et al. [1990].verwendete LösungenElektrodenpuffer (pH 11

7 Anhang-101-7.10 ImmunoblotDie immunochemische Detektion erfolgt unter Anwendung des Verstärkersystems nach VIETHS et al.[1992a].verwendete Lösungen

7 Anhang-102-DurchführungÞ Proteine analog 7.6 bzw. 7.7 auftrennenÞ Semidry-Blot entsprechend 7.9.1 durchführenÞ Blotmembran trocknen lassenÞ NC-M

1 Einleitung-4-Soforttyp-Reaktion zentrale Bedeutung desAntikörper IgE wurde erst 1967 vonISHIZAKA & ISHIZAKA zeitgleich mit JOHANS-SON & BENN

7 Anhang-103-7.12 ProfilinnachweisDer Nachweis auf Profilin wird nach der Methode von VIETHS et al. [1994a] und FÄH et al. [1995]durchgeführt.verwend

7 Anhang-104-DurchführungÞ Proteinauftrennung wie in Kapitel 7.6 bzw. 7.7 beschriebenÞ Gel in eine Kunststoff- oder Glaswanne überführenÞ mind. 30

7 Anhang-105-7.14 Unspezifische Färbung von Proteinen auf Membranen7.14.1 Brilliant Black-Färbung auf NC-MembranenDie unspezifische Visualisierung d

7 Anhang-106-DurchführungÞ Semidry-Blot entsprechend 7.9.2 durchführenÞ PVDF-Membran mit dest. H2O spülenÞ Für einige Sekunden mit Methanol konditi

7 Anhang-107-7.15.2 PeriodatspaltungDer Nachweis von Kohlenhydratstrukturen mittels Periodatspaltung erfolgt nach der Methode von VIETHSet al. [1995b

7 Anhang-108-7.15.4 Nachweis mittels AffinitätschromatographieDer Nachweis von Kohlenhydratstruktur mittels einer spezifischen Affinitätschromatograp

7 Anhang-109-7.16 Methoden zur Proteinisolatiierung7.16.1 IECDie Proteinisolierung über die IEC erfolgt in Anlehnung an die Methoden nach BALESTRIER

7 Anhang-110-7.16.2 SECDie Proteinisolierung über die SEC erfolgt modifiziert nach HAGEL et al. [1989].SEC-BedingungenPumpe: Merck Hitachi Pump L-710

7 Anhang-111-7.16.3 RP-HPLCDie Proteinisolierung an einer Umkehrphasen (RP)-Säule erfolgt modifiziert nach FAHLBUSCH et al.[1995].RPC-BedingungenPump

7 Anhang-112-7.19 Charakterisierung der verwendeten PatientenserenTab. 7-8: PatientenserenNr. PatientJhrg –Geschl.EAST-Klasse –Spez. IgE-Gehalt[U/mL]

1 Einleitung-5-die Konformationsepitope über ihre räumliche Gestaltung, der Sekundär- bzw. Tertiärstruktur,definiert werden [GLICK & PASTERNAK 199

7 Anhang-113-Nr. PatientJhrg –Geschl.EAST-Klasse –Spez. IgE-Gehalt[U/mL]KlinischeSymptomeAllergenbandenim Immunoblot[kDa]28SI68 - D2 - 1,802 JM, RH14;

7 Anhang-114-7.20 UntersuchungsmaterialIn nachstehender Tabelle sind alle untersuchten Tomatenvarietäten unter Angabe ihrerbesonderen Merkmale aufgef

7 Anhang-115-Tab. 7-13: SortenvergleichExtrakt MethodeProteinkonzentration[µg/mL]«Balkonstar» SDS-PAGE 277«Sweet million» SDS-PAGE 285«Togo Trefle » S

7 Anhang-116-Tab. 7-16: Tomatenbestandteile, IB-Inhibitionelektrophoretischgetrennter ExtraktProteinkonzentration[µg/mL]Inhibitor Proteinkonzentration

7 Anhang-117-Tab. 7-20: in vitro Verdau; Tomate: unbekannte SorteExtrakt Enzym Enzymkonz. pH-WertInkubationsdauer[min]Proteinkonzentration[µg/mL]nativ

7 Anhang-118-Tab. 7-23: Kreuzreaktivität, IB-Inhibition Ielektrophoretischgetrennter ExtraktProteinkonzentration[µg/mL]Inhibitor Proteinkonzentration[

7 Anhang-119-7.22 Ergebnisse der EAST-InhibitionTab. 7-25: Sortenunterschiede; Festphase: «Balkonstar»InhibitorKonzentration[µg/mL]Extinktion[Skt]Ext

7 Anhang-120-InhibitorKonzentration[µg/mL]Extinktion[Skt]ExtinktionOA [Skt]ExtinktionB0 [Skt]ExtinktionNSB [Skt]Inhibition[%]C50-Wert[µg/mL]460.0000 0

7 Anhang-121-Tab. 7-26: Reifung; Festphase: «Balkonstar», rotInhibitorKonzentration[µg/mL]Extinktion[Skt]ExtinktionOA [Skt]ExtinktionB0 [Skt]Extinktio

7 Anhang-122-Tab. 7-27: Tomatenbestandteile; Festphase: «Estrella», GesamtfruchtInhibitorKonzentration[µg/mL]Extinktion[Skt]ExtinktionOA [Skt]Extinkti

1 Einleitung-6-Bevor es zum klinischen Ausbruch einer Soforttyp-Reaktion kommt, geht dieser eine initialeSensibilisierungsphase gegen das betreffende

7 Anhang-123-Tab. 7-28: in-vitro-Magendauung; Festphase Tomate, nativInhibitorKonzentration[µg/mL]Extinktion[Skt]ExtinktionOA [Skt]ExtinktionB0 [Skt]E

7 Anhang-124-Fortsetzung Tab. 7-28InhibitorKonzentration[µg/mL]Extinktion[Skt]ExtinktionOA [Skt]ExtinktionB0 [Skt]ExtinktionNSB [Skt]Inhibition[%]C50-

7 Anhang-125-Fortsetzung Tab. 7-29InhibitorKonzentration[µg/mL]Extinktion[Skt]ExtinktionOA [Skt]ExtinktionB0 [Skt]ExtinktionNSB [Skt]Inhibition[%]C50-

7 Anhang-126-Fortsetzung Tab. 7-30InhibitorKonzentration[µg/mL]Extinktion[Skt]ExtinktionOA [Skt]ExtinktionB0 [Skt]ExtinktionNSB [Skt]Inhibition[%]C50-

7 Anhang-127-Tab. 7-31: Kreuzreaktivitäten II; Festphase: verschiedene Gemüse & FrüchteInhibitorKonzentration[µg/mL]Extinktion[Skt]ExtinktionOA [S

7 Anhang-128-Fortsetzung Tab. 7-31InhibitorKonzentration[µg/mL]Extinktion[Skt]ExtinktionOA [Skt]ExtinktionB0 [Skt]ExtinktionNSB [Skt]Inhibition[%]C50-

7 Anhang-129-Fortsetzung Tab. 7-31InhibitorKonzentration[µg/mL]Extinktion[Skt]ExtinktionOA [Skt]ExtinktionB0 [Skt]ExtinktionNSB [Skt]Inhibition[%]C50-

7 Anhang-130-Abb. 7-1: Densitogramme der Immunoblots verschiedener Reifestufen a: «Balkonstar»; grün b: «Balkonstar»; orange c: «Balkonstar»; rot d:

7 Anhang-131-7.24 Chemikalien. Geräte. Verbrauchsmaterialien & Zubehör7.24.1 ChemikalienAceton Merck F R11. S9-16-23.2-336-Aminohexansäure Merc

7 Anhang-132-Natriumazid Merck T+ R28-32. S28.1Natriumcarbonat. wasserfrei Merck Xi R36. S22-26Natriumchlorid MerckNatriumdihydrogenphosphat-Monohydra

1 Einleitung-7-zunächst an den Endothelzellen haften und treten mit Hilfe der Adhäsionsmoleküle alsdiffundierende Immunzellen [8] in die umgebende Gew

7 Anhang-133-Gefriertrocknungsanlage Gamma A Christ (Osterode. Deutschland)Beta 1-16 Christ (Osterode. Deutschland)Magnetrührer Heidolph (Schwabach. D

1 Einleitung-8-Die Diagnostik stützt sich heutzutage auf die vier Standbeine Anamnese, Kutantestungen, in-vitro-Diagnostik und Provokationstests. Um e

1 Einleitung-9-Eines der bedeutendsten, mit Lebensmittelallergien assoziierten Pollenallergene ist derBirkenpollen. So leiden zwischen 50 - 93 % der B

1 Einleitung-10-1.5 VerdauungZiel der Verdauung ist die Überführung der hochmolekularen Substanzen der Nahrung in fürden Organismus absorbierbare Ein

1 Einleitung-11-gegen Tomate wird oftmals lediglich im Zusammenhang mit einer Inhalationsallergie berichtet[HANNUKSELA & LATHI 1977, DE MARTINO et

1 Einleitung-12-zwischen 25 und 50 kDa und dazugehörigen isoelektrischen Punkten (pI) von 5.2 bis 9.6. Einbesonders intensiv anfärbbares Protein mit

Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von April 2000 bis Oktober 2002 unter Anleitung vonProf. Dr. Dr. H. Steinhart am Institut für Biochemie- und

2 Material-13-2 Material2.1 PatientenserenDie im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Blutseren resultieren aus einer Kooperation mit derHautklinik des

2 Material-14-Die Sortenvielfalt der Tomate läßt sich auf ca.1000 verschiedene Varietäten beziffern,welche bezüglich ihres Phänotypsvoneinander diverg

2 Material-15-Aus dem Samen des Weizens wird das kohlenhydratfreie und chitinbindende Lectin WheatGerm Agglutinin (WGA) gewonnen. Seine beiden Bindung

3 Methoden-16-3 Methoden3.1 MethodenübersichtFür die Realisierung der gesetzten Ziele dieser Arbeit wurden verschiedene immunologischeund chemische

3 Methoden-17-3.2 ProteinextraktionDie Basis für Untersuchungen von Lebensmittelallergenen wird von der Reproduzierbarkeitund der qualitativen Zusamm

3 Methoden-18-3.4 Enzymallergosorbent-Test (EAST)Der EAST gehört zu den wichtigsten in-vitro-Untersuchungsmethoden bei der Diagnostik vonLebensmittel

3 Methoden-19-Die Methode beruht auf der Konkurrenzreaktion zwischen den festphasengebundenen Aller-genen der nativen Frucht und den in Lösung befindl

3 Methoden-20-2-(N-morpholino)ethansulfonsäure (MES)-SDS-Elektrodenpuffer verwendet. Diese Systemzu-sammenstellung ermöglicht eine kontinuierliche Auf

3 Methoden-21-dungskapazität einer Membran hängt entscheidend von ihrer Porengröße ab, wobei eine Po-rengröße von 0.2 µm eine Immobilisierung von klei

3 Methoden-22-3.7.2 Immunoblot-InhibitionEntsprechend der unter 3.5 beschriebenen EAST-Inhibition ermöglicht auch die IB-Inhibitioneine Identifizieru

DanksagungenFür das Überlassen des Themas sowie der freundlichen Betreuung dieser Arbeit bedanke ichmich bei Herrn Prof. Dr. Dr. H. Steinhart und Frau

3 Methoden-23-die α(1,3)-Fucose und β(1,2)-Xylose im Verdacht, für die IgE Bindung verantwortlich zu sein[GARCIA-CASADO et al. 1996, WILSON & ALTM

3 Methoden-24-In Zusammenarbeit mit dem GKSS-Forschungszentrum Geesthacht wurde zum Nachweis vonGlykoproteinen eine dort entwickelte Lectin-Affinitäts

3 Methoden-25-3.10.1 Ionenaustauschchromatographie (IEC)Die IEC gehört aufgrund ihrer milden Trennbedingungen, welche eine Aufrechterhaltung derbiolo

3 Methoden-26-nicht als erster Schritt einer Trennung, da viele Begleitstoffe der Matrix aufgrund ihres hydro-phoben Charakters die Trennleistung der

4 Ergebnisse-27-4 ErgebnisseIm ersten Abschnitt dieses Kapitels werden die Ergebnisse zur umfassenden Charakterisierungder Tomatenallergene vorgestel

4 Ergebnisse-28-Bis auf die Einzelseren 12 und 19 wiesen alle Seren spezifische IgE-Antikörper gegenübereinem Allergen mit einem MG von 44 kDa auf, we

4 Ergebnisse-29-sowie deren Detektionshäufigkeit liefert Abb. 4-3. Die Antikörper von nur drei Serendetektierten Allergene im Bereich von 18 kDa (14,

4 Ergebnisse-30-In der unspezifischen Silberfärbung (Abb. 4-5 linke Seite) der zweidimensionalen Auftrennungist zu erkennen, daß die beiden Banden bei

4 Ergebnisse-31-Extrakte eine intensiv hervortretende Bande bei 44 kDa aufweisen, ist sie in den Extrakten derSorten «Togo Trefle» (2) und «Flamme» (3

4 Ergebnisse-32-Allergenspektrums keine Unterschiede festgestellt werden (Ergebnisse nicht dargestellt).Unspezifische Bindungen konnten durch die Inku

Inhaltsverzeichnis-I-Inhaltsverzeichnis1 Einleitung

4 Ergebnisse-33-4.1.5 ReifungUm eine potentielle Veränderung der Allergenität während des Reifungsprozesses zubestimmen, wurden vier verschiedene Rei

4 Ergebnisse-34-Während sich die Zunahme zwischen der grünen und orange-farbenen Reifestufe noch nichtso deutlich abzeichnete, war der Intensitätsunte

4 Ergebnisse-35-Verlauf der Reifung und war somit mit den Ergebnissen des Immunoblots vergleichbar.Während bei der unreifen, grünen Frucht eine Protei

4 Ergebnisse-36-MG <14 kDa sowie der Abwesenheit des 14 kDa Allergens manifestierten. Der Extrakt desSamens (6) zeigte im Bereich zwischen 16 und 3

4 Ergebnisse-37-Schale entsprechend der homologen Inhibition geschwächt werden. Alle anderen Allergenewaren weiterhin vorhanden. Die Extrakte des Peri

4 Ergebnisse-38-zudem in dem mit einer maximalen Inhibition von 48 % nicht erreichten C50-Wert wider. ImVergleich dazu liegen die zur 50 %igen Inhibit

4 Ergebnisse-39-Allergenmustern überein. Auch dort konnten in den Extrakten der Pulpa und des Samens keineIgE-bindenden Proteine mit einem MG von 14 k

4 Ergebnisse-40-Extrakt der Tomate, konnten anhand der PAS-Färbung nicht als Glycoproteine identifiziertwerden. Um eine eventuelle Beteiligung des Koh

4 Ergebnisse-41-4.1.8.2 Nachweis mittels LectinenEine im Vergleich zur PAS-Färbung weitaus empfindlichere Methode zum Nachweis vonGlycoproteinen wird

4 Ergebnisse-42-vorhergehende Inkubation mit Lectinen, bei welchem keine Banden visualisierbar waren,können unspezifische Bindungen ausgeschlossen wer

Inhaltsverzeichnis-II-3.10.3 Umkehrphasen Chromatographie (RPC) 253.11 Entsalzung über Dialyse 263.12 N-terminale Sequenzanalyse 264 Ergebn

4 Ergebnisse-43-Glycoproteine wurde zudem eine Immunfärbung unter Verwendung des Patientenserumsdurchgeführt, welche ebenfalls in Abb. 4-18b gezeigt i

4 Ergebnisse-44-Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß in der Tomatenfrucht eine Vielzahl vonGlycoproteinen vorhanden sind. Durch die spezifisc

4 Ergebnisse-45-Dagegen zeigte dieser Extrakt das für die Tomate spezifische Allergenmuster und ließ keineUnterschiede zu dem der nativen Tomate erken

4 Ergebnisse-46-steigender Pepsinkonzentration festzustellen war. Der pH-Wert von 1.2 hat entsprechend demErgebnis des Immunoblots keinen Einfluß auf

4 Ergebnisse-47-zustande gekommen sein könnte, da nach erfolgter Pepsininkubation (vgl. Abb. 4-20) diesenoch vorhanden war. Weiterhin kam es zum Abbau

4 Ergebnisse-48-der mit Proteinase K inkubierte Extrakt mit einem C50-Wert von 99.3 µg/mL die geringsteAktivität. Entsprechend dem Immunoblot zeigten

4 Ergebnisse-49-konnte das von SEPPÄLÄ et al. [1999] beschriebene Hauptallergen Sol t 1 (Patatin) mit einemMG von 43 kDa sowie die Allergene Sol t 2 -

4 Ergebnisse-50-(11) führte lediglich zur Hemmung des 14 kDa-Allergens. Die anderen Banden waren in z.T.leicht geschwächter Intensität noch deutlich v

4 Ergebnisse-51-1.7 µg/mL waren sie nur leicht zu höheren Proteinkonzentrationen verschoben. Einen etwasstärker erhöhten C50-Wert wies der Extrakt des

4 Ergebnisse-52- MGM 1 2 3 4 K 1 2 3 4 K 1 2 3 4 K 1 2 3 4 K BBF

Abkürzungsverzeichnis-III-Abkürzungsverzeichnis2D 2-dimensionalAAA Aleuria aurentia Agglutinin LectinAC AffinitätschromatographieAP Alkalische Phospha

4 Ergebnisse-53-Das im Apfelextrakt intensiv detektierte Hauptallergen Mal d 1 konnte durch die homologeInhibition vollständig inhibiert werden, wohin

4 Ergebnisse-54-4.2 Isolierung von TomatenallergenenIn den folgenden Kapiteln werden die erarbeiteten Ansätze zur Isolierung von Tomaten-allergenen d

4 Ergebnisse-55-Da die IEC durch einen hohen Salzgehalt erheblich gestört und die Trennleistung deutlichherabgesetzt wird, wurden die Proteine aus dem

4 Ergebnisse-56-Daneben sind nur wenige, deutlich schwächer detektierte Proteine mit einem höheren als auchniedrigeren MG detektierbar. Zudem ist gut

4 Ergebnisse-57-Unter Verwendung des Poolserums wurden anschließend die Fraktionen bezüglich der darinvorkommenden IgE-bindenden Proteine mittels IB u

4 Ergebnisse-58-Fraktionen der IEC zwar nur noch wenige Allergene bzw. weitere Begleitproteine apparentwaren, war die IEC für eine vollständige Isolie

4 Ergebnisse-59-Verwendung des Poolserums durchgeführt. Aus dem in Abb. 4-38 wiedergegebenen IB ist klarersichtlich, daß, entsprechend der Silberfärbu

4 Ergebnisse-60-4.2.1.3 N-terminale SequenzierungUm über den Vergleich mit Proteindatenbanken eine eventuelle Identifizierung des isoliertenAllergens

4 Ergebnisse-61-4.2.2.1 IECDer aus dem Acetonpulver unter Verwendung des Tris-HCl-Puffers gewonnene Extrakt wurdeentsprechend der in 4.2.1.1 aufgefüh

4 Ergebnisse-62-Proteinextraktes der Sorte «Balkonstar» dargestellt. Entsprechend der IEC-Trennung desExtraktes der unbekannten Sorte wurde auch bei d

Abkürzungsverzeichnis-IV-MOPS 3-(N-morpholino)propansulfonsäureNC NitrocelluloseNSD Nicht spezifische BindungOAS Orales Allergie SyndromPAGE Polyacryl

4 Ergebnisse-63-Um diesen Unterschied dieser beiden Sorten bezüglich der Apparenz des 26 kDa-Allergensmit einem abgeschätzten pI von 5.3 zu verifizier

4 Ergebnisse-64-Vor einer weiteren Auftrennung mittels SEC wurde die IEC-Fraktion 3 des Extraktes der Sorte«Balkonstar» lyophilisiert und in 1 mL des

4 Ergebnisse-65-Visualisierung der Proteine der SEC-Fraktion ist in Abb. 4-44 dargestellt. Während in Fraktion1 der SEC keine Proteinbanden detektiert

4 Ergebnisse-66-Fraktionierung anhand des Chromatogramms ebenfalls nicht möglich, so daß von einerweiteren Trennung mittels SEC abgesehen wurde.4.2.2.

4 Ergebnisse-67-4.2.2.4 N-terminale SequenzierungObwohl keine vollständige Isolierung des 26 kDa-Allergens erreicht werden konnte, wurdeeine N-termin

5 Diskussion-68-5 DiskussionMit der vorliegenden Arbeit sollte zum einem eine umfassende Charakterisierung der IgE-bindenden Proteine der Tomate durc

5 Diskussion-69-Heterogenität der individuellen Sensibilisierungsspektren feststellen, wodurch auch dieDifferenzen der angegebenen MG der Tomatenaller

5 Diskussion-70-Buschtomaten gezählt werden. Obwohl die genaue Sortenbezeichnung der «unbekannteSorte» nicht bekannt war, gehört sie ebenso wie die So

5 Diskussion-71-Anstieg der Allergenkonzentration während des Reifungsprozesses. Sie dokumentierten in denreiferen Früchten ebenfalls einen höheren Ge

5 Diskussion-72-Anhand eines gegen rekombinantes Birnenprofilin gerichteten Antikörpers wurde die Präsenzvon Profilinen in den unterschiedlichen Tomat

1 Einleitung-1-1 EinleitungSchon zu Zeiten des HIPPOKRATES (460-377 v. Chr.) wurden Überempfindlichkeitsreaktionengegenüber Lebensmitteln beschrieben

5 Diskussion-73-drastischen Reduzierung der IgE-bindenden Proteine, wobei lediglich das Profilin nochdetektierbar war. Eine sensiblere Methode zum Nac

5 Diskussion-74-beschriebene 35 kDa-Allergen mit der allergenen Bande bei 36 kDa, welche nach derPeriodatbehandlung nicht mehr apparent war, übereinst

5 Diskussion-75-[1999] in Avocados nachgewiesen wurden. Durch die EAST-Inhibition konnte, entsprechendder Ergebnisse des IB, eine leichte Reduktion de

5 Diskussion-76-konnte eine IgE-bindende Bande mit einem MG von 23 kDa nachgewiesen werden, welcheaus der Hydrolyse des Hauptallergens der Erdnuß (66

5 Diskussion-77-verwandten Lebensmitteln zeigte die latexassoziierte Banane eine schwächere immunologischeBeziehung zu den Tomatenallergenen. In der I

5 Diskussion-78-und Sellerie gezeigt, darf eine Kreuzreaktivität der Tomate mit birkenpollenassoziiertenLebensmitteln jedoch nicht unterschätzt werden

5 Diskussion-79-Fraktionen der IEC erwies sich die RPC als geeignet. Die isolierten Allergene wurden einer N-terminalen Sequenzanalyse unterzogen. Dab

5 Diskussion-80-Tomate erfolgen. Des weiteren sollten in diesen Studien die sortenspezifischen Unterschiedeberücksichtigt und verifiziert werden. Die

6 Zusammenfassung / Summary-81-6 Zusammenfassung / SummaryDie vorliegende Arbeit hatte eine umfassende Charakterisierung der Allergene der Tomatezum

6 Zusammenfassung / Summary-82-Bande als Profilin identifiziert werden. Außer im Samen, bei welchem im Profilinblot keineBande detektiert werden konnt

1 Einleitung-2-1.1 Problemstellung und ArbeitsplanTrotz intensiver Forschung ist es noch nicht möglich, die Fehlsteuerung des Immunsystems zukorrigie

6 Zusammenfassung / Summary-83-Sequenzierung dieses Allergens erfolgte daher aus der vorgereinigten IEC-Fraktion. Dabeizeigte sich eine 75 %ige Homolo

6 Zusammenfassung / Summary-84-band was detected in the profilin blot, the above mentioned band was apparent for all theother fragments of the fruit.

7 Anhang-85-7 Anhang7.1 Gewinnen der PatientenserenÞ 10 mL Blut mittels Serumröhrchen abnehmenÞ mind. 30 min abkühlen lassenÞ 10 min bei 4 °C un

7 Anhang-86-ProteinextrakteÞ 0.5 - 3 g Acetonpulver einwiegenÞ 15 mL PBS-Lsg. hinzufügenÞ pH-Wert mit 0.1 mol/L NaOH auf pH 7.4 einstellenÞ 1 h un

7 Anhang-87-Tab. 7-2: Bedingungen der simulierten DarmverdauungEnzym pH-Wert EnzymkonzentrationInkubationszeit[min]--1.27.5--60120PepsinPankreatin1.27

7 Anhang-88-Þ bei 37° im Umlufttrockenschrank unter Rühren für verschiedene Zeiten (Vergleich Tab. 7-2)inkubierenÞ Suspension für 20 min bei 90 °C e

7 Anhang-89-7.4 Enzymallergosorbent-Test (EAST)7.4.1 Herstellung der AllergenscheibenBromcyanaktivierungDie Bromcyanaktivierung sowie die Kopplung d

7 Anhang-90-Entsorgung der BromcyanabfälleÞ BrCN-Lösung in 10 %iger Natronlauge 1 h stehenlassenÞ bei einem pH-Wert von 10-11 einen 50 % igen Übersc

7 Anhang-91-Natriumacetatpuffer:0.1 mol/L4.2 g Natriumacetatad 500 mL dest. H2Omit 4 mol/L HCl auf pH 4.0 einstellenDurchführungÞ Extrakte in bidest.

7 Anhang-92-Referenzlösungen: Kalibrierreihe mit vier SerenA = 0.35 U/mL spez. IgE gegen Lieschgras (EAST-Klasse 1)B = 0.7 U/mL spez. IgE gegen Lie