Zanussi DR 50/2 - DR 56/2 Manuel d'utilisateur

Multiplex szérum-citokinszint vizsgálatok jelentősége különböző kórképekben Doktori értekezés Dr. Bekő Gabriella Semmelweis Egyetem Klinikai Or

10 A legtöbb IL-1α molekula a sejt citoszoljában marad, ahol valószínűleg az IL-1 termelődés autokrin szabályozásában van szerepe. A prekurzor a sej

100 scavengelése miatt a luminol nem bomlik el a vizsgálati idő alatt, és a műszer szignifikánsan kis fényintenzitást detektál [Blázovics és mtsai 20

101 inflammation complex syndrome’ (MICS)) nevezik. A MICS összefügg az oxidatív stressz [Pou és mtsai 2007], az eritropoietin rezisztencia [Agarwal

102 gyulladásos komponenst is mér. Míg a regressziós modellekben feltételezzük, hogy a magyarázó változókat hibamentesen mértük, a SEM modellben

103 Tézisek 1. A multiplex citokinszint-mérő rendszerekkel mért analitok szintje esetenként nagymértékben eltérő lehet, ezért a metodik

104 Összefoglalás Ph.D. munkám során a laboratóriumban olyan rendszereket honosítottam meg, melyekkel egyidejűleg több citokin szintjét lehet me

105 Summary During my Ph.D. work I introduced complex systems into the laboratory that enable us to determinate simultaneously the level of several c

106 Irodalomjegyzék 1. Abbas AK, Lichtman AH. (2003) Cellular and molecular biology, 5th Edition, Saunders, Philadelphia 2. Agarwal R, Da

107 13. Baylin SB, Ohm JE. (2006) Epigenetic gene silencing in cancer – a mechanism for early oncogenic pathway addiction? Nat Rev Cancer 6:107-116.

108 24. Bekő G, Osztovits J, Visnyei Z., Szalay F., Sátory A,. Blázovics A, Szentmihályi K. (2009) Significance of measurement and difference of spec

109 35. Blázovics A, Kovács A, Lugasi A, Hagymási K, Bíró L, Fehér J. (1999) Antioxidant defence in erythrocytes and plasma of patients

11 Interleukin-6 Az IL-6-ot monociták, makrofágok és endotélsejtek termelik. Sokáig proinflammatorikus citokinnek tekintették, mely LPS hatás

110 metallothionein induction in rats with experimental cirrhosis. Int J Vitam Nutr Res.71:229-236. 47. Callaway CW, Rittenberger JC, Logue ES,

111 59. Delespesse G, Demeure CE, Yang LP, Ohshima Y, Byun DG, Shu U. (1997) In vitro maturation of naive human CD4+ T lymphocytes into

112 73. Fehér A, Olajos F, Nobilis A, Novák M, Bekő G (2009) Monitoring of procalcitonin and C-reactive protein level of prematures and newborn

113 87. Hatano T, Kagawa H, Yasuhara T, Okuda T. (1988) Two new flavonoids and other constituents in licore root: their relative astring

114 101. Kasdallah-Grissa A, Mornagui B, Aouani E, Hammami M, El May M, Gharbi N, Kamoun A, El-Fazaâ S. (2007) Resveratrol, a red wine polyp

115 112. Köhidai L, Csaba G (1998). "Chemotaxis and chemotactic selection induced with cytokines (IL-8, RANTES and TNF-alpha) in the unicellula

116 125. Matsui T, Kakeda T. (2008) IL-10 production is reduced by hypotermia but augmented by hypertermia in rat microglia. J Neurotrauma 25:709-71

117 138. Ng PC, Lee CH, Lam CW, Ma KC, Chan IH, Wong E, Fok TF. (2004) Transient adrenocortical insufficiency of prematurity and

118 152. Poikolainen K, Alho H. (2008) Magnesium treatment in alcoholics: a randomized clinical trial. Subst Abuse Treat Prev Policy 25:3-5. 153. P

119 162. Róka A, Vásárhelyi B, Bodrogi E, Machay T, Szabó M. (2008) Elevated morphine concentrations in neonates treated with morphine a

12 szabadulnak fel belőlük, megindul a légzési burst. Fagocitózist indukál, a fagocitált antigén hatására toll-like receptor képződés kezd

120 175. Stanley LL, Mazier MJ. (1999) Potential explanations for the French paradox. Nutr Res 19:3–15. 176. Stenvinkel P, Heimbürger O, Lindholm B

121 188. Treszl A, Héninger E, Kálmán A, Schuler A, Tulassay T, Vásárhelyi B. (2003) Lower prevalence of IL-4 receptor alpha-chain gene

122 200. Walsh TJ, Tilson HA (1984) Neurobehavioral toxicology of the organoleads. Neurotoxicology. 5:67-86. 201. Wang AY, Woo J, Lam CW,

123 A dolgozathoz kapcsolódó közlemények Folyóiratcikkek 1. Bekő G, Hagymási K, Szentmihályi K, Bányai ES, Osztovits J, Fodor J, Fehér J, Blázovic

124 1. Bekő G, Ostovits J, Visnyei Zs, Szalay F, Sátori A, Blázovics A, Szentmihályi K. (2009) Significant difference in the concentration of Spec

125 biliary cirrhosis. 50th Annual Meeting of the Hungarian Society of Gastroenterology Tihany, June 6-11. Z. Gastroenterol. 46, 487-522, p

126 cancer. XVIII. International Semmelweis Symposium of Urology 2009 , Uro Onkológia 2009; 4, pp. 22 19. Bekő G, Blázovics A, Szentmihályi K

127 Disszertációtól független közlemények Folyóiratcikkek: 1. Bekő G, Varga I, Gláz E, Sereg M, Feldman K, Tóth M, Racz K, Patocs A. (2009), Cut-o

128 Idézhető absztraktok és előadások 1. Szentmihályi K, Bekő G, Székely E., May Z, Blázovics A.(2009)Selenium determination in blood samples

129 Egyéb előadások 12. Hegedűs V., Mihály Z. Szijártó A. Gerő D. Bekő G. Lotz G. Monostory K., Szentmihályi K., Blázovics A.: Molekuláris bi

13 A citokin termelésében részt vesznek az aktivált T-sejtek, hízósejtek, természetes ölő sejtek (natural killer-sejtek), Kupffer-sejte

130 Köszönetnyilvánítás Mindenek előtt köszönetet szeretnék mondani témavezetőmnek, Dr. Blázovics Annának, a MTA doktorának, aki létrehozta azt a sze

131 Közülük is ki kell emelnem Dr. Ph.D. Szabó Miklós adjunktust az I.sz. Gyermekgyógyászati Klinikáról, Dr. Ph.D. Nyirády Péter docenst,

14 formában fordul elő. Hatását II-es típusú citokinreceptoron keresztül STAT1 kinázon keresztül fejti ki. Az aktivált makrofágok kóro

15 azonnali allergiás reakciók mediálásában. Az IL-4 emellett a mucin-gén expressziójának fokozásával hajlamosít a légúti obstrukció kialakulás

16 makrofágepitélsejtekagyT-sejtlimfokin-termelés ↑IFNCSFIL-4, IL-5LDCFIL-2IL-6, IL-8, TNF,GM-CSF, ICAM-1 ↑IL-2- és IFNreceptorok γ−↑proliferáció,el

17 3. ábra: A kiváltó ágens hatására reagáló sejtek citokineket termelnek, melyek meghatározzák az immunreakció jellegét (Gergely J, Erdei A. Immu

18 tartományt is alapvetően meghatározza a gyártás technológiája, a vegyszer sorozatszáma. [Bekő és mtsai 2008] 2) Nyugalmi állapotban a

19 CCD (charge couple device) kamerával és standard kalibrációs görbékhez hasonlítva kiértékeli egy speciális programmal a teljes arrayn. E

2 Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék ... 2 Rövid

20 költsége harmada az ELISA módszerrel mért tesztekének, ráadásul minél több tesztet mérünk egy plexben, a fajlagos költség annál kisebb. [Bekő

21 3 Célkitűzések Ph.D. munkám során metodikai és klinikai kérdésekre kerestem választ. A módszertani vizsgálatokon belül a citokinszint

22 rapid lefolyású, és a gyors diagnózis alapvetően fontos a hatékony terápia mielőbbi bevezetése és a súlyos szövődmények megelőzése érd

23 tünetcsoportokban szenvedő betegeknél milyen különbségek lehetnek jelen a szisztémás gyulladást jelző citokinszintek, a fémionszintek és redox-fo

24 4 Betegek, módszerek és anyagok Az egyes vizsgálatokba a betegek bevonása intézeti tudományos kutatásetikai bizottságok előzetes jóváh

25 protokollnak megfelelő módon kaptak morfint is [Azzopardi és mtsai 2008]. Egyetlen gyermeknél sem volt jelen szepszis, anyai korioamnionitisz. K

26 vettünk 0,5 ml lítium-heparinnal alvadásgátolt vérmintát a születéskor, majd az 1, 3. és 7. életnapon; a citokinszinteket az ebből nyert plazmába

27 (átlagos alkoholbevitel: <20 gramm/hét), nem dohányoztak, nem szedtek étrendkiegészítőt, illetve a nők nem használtak fogamzásgátló tab

28 4.2.3 Citokinek egyéb belgyógyászati kórképekben 4.2.3.1 Prosztatakarcinóma és citokinprofil A Semmelweis Egyetem Urológiai Klinikáról 18 átté

29 2. táblázat: Avesetranszplantált betegek kórtörténeti adatai (rövidítés: IQR= interkvartilis ) Összes beteg (n = 993) Férfiak (n = 569) Nők

3 5.2.2.1 A vörösborfogyasztás hatása a citokinszintekre ...62 5.2.2.2 Citokinprofil és májcirrhosis...

30 3. táblázat: Malnutríció – inflammáció pontérték megállapításához használt adatlap Malnutríciós-gyulladásos pontérték (MIS) 0 1 2 3 1 – Súlyvá

31 4.3 Módszerek 4.3.1 Citokinszint-mérési eljárások 4.3.1.1 Citokinszintek mérése Bioplex rendszerrel A vizsgálatokat Bio Rad Bio-Plex System t

32 4. táblázat: Mérési helyek kiosztása a 96-os plate-en Felhasznált mérési helyek Mikrorészecske koncentrátum Mikrorészecske hígító 96 50 µl 5 ml

33 minta duplikált eredményeinek átlagát vettük és kivontuk az átlag vak RFU (relative fluorescens unit) középértékét. Standard görbét készíte

34 Az evidence investigator™ Citokin Array egyszerre határozza meg az IL-1α, IL-1ß, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, VEGF, IFNγ, EGF, MCP-1 és TNFα sz

35 14. Közvetlenül a jelölő hozzáadása előtt a mosópuffert egy határozott mozdulattal eltávolítottuk, majd a hordozót szűrőpapírra hel

36 Az eredmények kiszámítása Az eredményeket a készülék a kalibrációs görbe alapján határozza meg, amelyet készülék-specifikusan, 2-pontos kalibrá

37 7. Az egyes mélyedésekbe 200 µl szubsztrátoldatot mértünk be, majd 20 percen keresztül szobahőmérsékleten inkubáltuk, fénytől védve. 8

38 Germany). A vérminták (1 ml) salétromsav (5 ml) és hidrogénperoxid (2 ml) keverékével történő roncsolása, majd 10 ml desztillált

39 gátlás % = [Abs(kontroll) - Abs(minta)] / Abs(kontroll)x100] [Hatano és mtsai 1988]. Össz –scavenger kapacitás meghatározása Csekély mennyiségű h

4 Rövidítésjegyzék ALAT alanin-aminotranszferáz ALP alkalikus foszfatáz ASAT aszpartát-aminotranszferáz APC antigénprezentáló sejt BMI testtöm

40 mértük a minta fluorescens emisszióját 570-660 nm között Hitachi F-4010 spektrofluoriméterrel [Chisolm és mtsai 1976]. 4.4 A vizsgálato

41 5 Eredmények 5.1 Összehasonlító vizsgálatok A különböző mérési rendszerek között lényeges különbségek vannak (antitestek eltérőek, vizsgálat

42 IL-6 szint Roche, Biochip és Bioplex módszerrel1101001000100001 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19betegekIL-6 pg/mlIL-6(Roche)IL-6Bio

436. táblázat: Biochip és Bioplex rendszerekkel mért citokinszintek, és ezek összefüggése BLD = kimutathatósági határ alatt IL-6 IL-2 IL-8 IL-

44 Az esetenként gyenge erősségű összefüggéseken túl az egyes rendszerekkel mért citokinszintek között szisztémás eltérést is kimutattu

45 (gyakran extrém) citokinszintek tendenciájukban összehasonlíthatóvá válnak. A relatív hatásokat az SAS program F1_LD_F1.sas makró alkalmazásával s

46 A proinflammatorikus citokinszintek közös jellemzésére bevezetett REV értékek esetében a 6. és a 72. posztnatális óra között a posztnatális kor kö

477. táblázat: Citokinszintek hipotermiás és normotermiás körülmények között kezelt aszfixiás újszülötteknél a 6 – 72. posztnatális órában. BLD = ki

48 5. ábra: IL-6 szintek hipotermiában és normotermiában (medián, interkvartilis tartomány) 6. ábra: IL-10 szintek hipotermiában és normotermiába

49 0 10 20 30 40 50 60 70 80Posztnatális kor (óra)0,10,20,30,40,50,60,70,8REVHypothermia Normothermia 7. ábra: ’measures ANOVA’ teszt: a posztnatális

5 IL-8 interleukin-8 IL-10 interleukin-10 IL-12 interleukin-12 IQR interkvartilis tartomány LAK-sejt Limfokin Aktivált Killer-sejt LPS lipopo

50 0 10 20 30 40 50 60 70 80Posztnatális kor (óra)0,10,20,30,40,50,60,70,8REVHypothermia Normothermia 9. ábra: ‘Repeated measures ANOVA’ teszt a posz

51 Az endogén kortizolszint egészséges referenciatartománya kora- és újszülöttkorban nagyon tág határok között változik: gyakorlatilag eddig m

528. táblázat: Kissúlyú koraszülöttek citokin- és kortizolszintje az első hét életnapon. (Adatok medián, kvartilis formában megadva; IL= interleukin

53 9. táblázat: táblázat Magas endogén kortizolszintű kissúlyú koraszülöttek citokin- és kortizolszintje az első hét életnapon (Adatok medián, kva

5410. táblázat: Alacsony endogén kortizolszintű kissúlyú koraszülöttek citokin- és kortizolszintje az első hét életnapon (Adatok medián, kvartilis f

55 Az ’alacsony’ és a ’magas’ kortizolszintű csoportok kialakítása a 0, 1, 3. és 7. napon mért kortizolszintek medián értékei alapján történt. A

56 10. ábra: Koraszülöttek proinflammatorikus citokinszintjeinek endogén kortizoltól, érettségtől és posztnatális kortól való függése, REV értékekre

57 A citokinek és az endogén kortizolszintek közötti kapcsolatot az 5.2.1.1. részben tárgyalt aszfixiás újszülöttek esetében is vizsgáltuk. Kide

58 11. táblázat: A kortizol, a hipotermiás kezelés és a posztnatális kor, illetve ezek interakciójának az egyes citokinekre gyakorolt hatása és szi

59 13. ábra: A kortizol, a hipotermiás kezelés és a posztnatális kor, illetve ezek interakciójának az egyes citokinekre gyakorolt hatása és szignif

6 1 Előszó A Semmelweis Egyetem Központi Laboratóriumának vezetőjeként számos olyan kérdéssel, megoldandó problémával találkozom, melynek kapc

60 emelkedett IL-8-at mutató 15 gyermek közül 6-nál az egészséges referenciatartományon belül volt a prokalcitonin és CRP szintje; azaz

61 13. táblázat: A mért gyulladásos citokinek (pg/ml), CRP (mg/l) és PCT (µg/l), valamint a FVS (G/l) közötti kapcsolat erőssége (r értékek) szeptiku

62 5.2.2 Citokinek májbetegségekben. A fémion-koncentrációk összefüggése a szisztémás citokinszintekkel 5.2.2.1 A vörösborfogyasztás hatása

63 14. táblázat: Májfunkciós vizsgálatok eredménye a vizsgálat kezdetekor, majd egy hónapig tartó mérsékelt vörösborfogyasztást követően Paraméterek

64 16. táblázat: Egy hónapig tartó mérsékelt (nőknél 0,2 l/nap, férfiaknál 0,3 l/nap mennyiségű) vörösborfogyasztás hatása a vörösvértestekben mért f

65 14. ábra: Egy hónapig tartó mérsékelt vörösborfogyasztás hatása az antioxidáns paraméterekre nőknél és férfiaknál

66 17. táblázat: Kapcsolat a fémionok, antioxidáns paraméterek és citokinszintek között (r és p értékek) (red = redukáló képesség (%), HDON = hidrogé

67 5.2.2.2 Citokinprofil és májcirrhosis A májfibrózis és májcirrhosis ugyanannak a kórfolyamatnak a különböző állomásai. A májfibrózis e

68 5.2.2.3 Wilson-kór és citokinek A Wilson-kór a májban zajló rézmetabolizmus autoszomális recesszív módon öröklődő rendellenessége, aminek

69 19. táblázat: Vörösvértestek fémionszintje (átlag ± szórás) egészséges kontrollokban és Wilson-kóros betegekben Neurológiai tünetekkel Fémion (µg/

7 jellemzésére, kinetikájuk leírására, ezért erőfeszítéseket tettünk új, a citokinszintek komplex értelmezését lehetővé tevő statisztikai mo

70 20. táblázat: Főbb citokinszintek az egyes Wilson-kór altípusokban (tünetmentes: még nincsenek szövődmények; IL = interleukin, IFN = interferon, T

71 21. táblázat: Klinikai kémiai laboratóriumi paraméterek és antioxidáns védekezés idegrendszeri tünetekkel járó és nem járó Wilson-kórban (ASAT =

72 15. ábra: Vörösvérsejtekben levő antioxidáns enzimek aktivitása és kemilumineszcens intenzitása a Wilson-kór egyes altípusaiban. (ideg : csak ide

73 vagy nem változott (TNF-α). A VEGF gyakorlatilag nem változott, az EGF közel duplájára nőtt (p=0,003). Hasonlóképpen kismértékben nőtt a PSA és fP

74 22. táblázat: Céklakivonat adás hatása kemoterápiában részesülő metasztatikus prosztatarákos betegek citokinszintjeire, illetve a növekedési hormo

75 23. táblázat: Cékla-kezelés hatása kemoterápiában részesülő metasztatikus prosztatarákos betegek redox-paramétereire és Zn-protoporfirin-szintjére

76 Inflammation Score, MIS) alkalmazhatóságát vizsgáltuk vesetranszplantált betegeknél a MICS kockázatának felmérésére. A vizsgálat során mér

77 25. táblázat: Malnutríciós és gyulladásos paraméterek a vesetranszplantált betegeknél (SD = szórás, IQR = interkvartilis tartomány, NS = nem szign

78 26. táblázat: A MIS score és a legfontosabb laboratóriumi, antropometriás és demográfiás adatok közötti nem korrigált és korrigált összefüggések e

79 Gyulladásos markerek: A szérum IL-6-szint a MIS kvartilisek alapján képzett négy alcsoportban a MIS emelkedésével arányosan egyre magasabb volt (p

8 2 Bevezetés 2.1 A citokinek Az immunrendszer sejtjei között a kommunikáció citokineken, kis, 8 -40 kDa nagyságú fehérjemolekulákon ke

80 Malnutríciós markerek Az alcsoportokban a haskörfogat mediánértéke a nagyobb MIS kvartilisekben szignifikánsan csökkent (p<0,001) (18.

81 pontosabban illeszkedett a vizsgálat adataihoz, mint a csak egy kompozit változót feltételező modell. A 19. ábra a MIS strukturális egy

82 6 Megbeszélés Az immunrendszer sejtjei között a kommunikáció citokineken, ezeken a kisméretű, 8 000-40 000 Da nagyságú fehérjemolekulákon ker

83 egy adott rendszerrel mért citokinértékek nem használhatóak fel olyan kísérletek során, melyekben egyéb módon (is) mértek citokinszintek

84 Korábbi vizsgálatok alapján hipoxiás-iszkémiás inzultus esetén az IL-6, IL-8 és IL-10 szintek a plazmában [Aly és mtsai 2006, Okazaki és

85 mtsai [2008] szerint újszülöttkori patkány mikroglia tenyészetben hipotermiás körülmények között az IL-10 citokinszint-termelés alacso

86 Koraszülötteknél a keringő kortizolszintet számos tényező befolyásolja: a hipotalamusz-hipofízis tengely éretlensége, a szülés módja és az

87 megmagyarázható hipotermia, hiperpigmentáció, hiperkalémia és hiponatrémia, émelygés, hányás és hasi fájdalom, valamint a folyadékra, kateko

88 Másik elemzésünket aszfixiás újszülöttek esetében végeztük. Eredményeink ebben az esetben is igazolták, hogy az endogén kortizolszin

89 Az általunk vizsgált populációban az első napon, az antibiotikus kezelés megkezdése előtt mért a CRP- és/vagy prokalcitonin-szint a szeptikus újsz

9 Gén-aktivációReceptorSignalCitokinBiológiaihatásokCélsejtIndukáló stimulusCitokintermelő sejta citokint termelő sejtközeli sejttávol lévő sejtkeri

90 6.2.2 Citokinek májbetegségekben. A fémion-koncentrációk összefüggése a szisztémás citokinszintekkel Számos adat utal arra, hogy a nők érz

91 egérmodelljében meg lehet szüntetni a zsírmájat, valószínűleg az intracelluláris jelátvitelre és zsírmetabolizmusra gyakorolt hatása

92 [Lavid és mtsai 2001; Shalan és mtsai 2005] Az alumíniumszint esetében észlelt hasonló mértékű csökkenés ezt a kelátor hatást valószínűsíti. A fé

93 B gyűrűn vicinális hidroxilcsoportokat tartalmazók (kvercetin, kvercitrin, miricetin) is szerepet játszhat. (Utóbbinak azonban a nemek kö

94 makrofágok a felelősek. Ezek a citokinek olyan szignálokat indíthatnak el, melyek eredményeként a májsejtek apoptózisa következhet be, b

95 emelkedése karakterisztikus, míg alkoholos eredetű májcirrhosisban a szisztémás gyulladásra utaló jel – a magasabb IL-6 szintek kivételéve

96 alumínium célszerve a csont, agy, vese és gyomor. Az alumíniummérgezés főbb tünete a bélfalizomzat görcse, demencia, gasztroenterit

97 Ismert, hogy számos neurodegeneratív betegségben a citokinszint megváltozása szerepet játszik [Rojo és mtsai 2008, Shaftel és mtsai 2008]. Perry é

98 részesülő prosztatarákos betegek táplálkozásjavításának. Célkitűzésünk annak a vizsgálata volt, hogy prosztatakarcinómás betegeknél liofilizál

99 és mtsai 2009]. Ezeknek a megfigyeléseknek a hátterében egy komplex rendszer jelenléte igazolódott. Az utóbbi két évtizedben igazol